Nachwuchsförderung 2022

Beitrag von Leopold Henßler

Universitätsklinikum Regensburg, Klinik und Poliklinik für Unfallchirurgie

Makroskopische Darstellung nekrotischer Knochenareale mithilfe der ossären Autofluoreszenz (VELscope®) zur Verbesserung des knöchernen Debridements – Eine experimentelle Studie

Abstract:

Chronischen Knocheninfektion führen u.a. zu Nekrosen des betroffenen Knochenareals [1]. Die chirurgische Resektion des gesamten Nekroseareals ist entscheidend für den Erfolg der Therapie [2–4]. Die Lokalisation und Ausdehnung des infizierten Areals kann sowohl prä- als auch intraoperativ häufig nur abgeschätzt werden. Um eine sichere Entfernung des gesamten nekrotischen Knochens zu gewährleisten, ist häufig eine ausgedehnte Resektion des infizierten Knochenareals mit anschließender schwieriger Rekonstruktion der entstandenen segmentalen Defekte notwendig [3,5,6].

Eine mögliche Hilfestellung in der intraoperativen Darstellung des Nekroseareals könnte ein Verfahren zur Fluoreszenz-Darstellung des Knochens mittels der sog. VELscope®-Technologie bieten. Die Methode basiert auf einem unterschiedlichen Fluoreszenzverhalten von vitalem und avitalem Knochen und konnte in der Vergangenheit bereits erfolgreich im Bereich der Mund-, Kiefer- und Gesichtschirurgie (MKG) zur Detektion und vollständigen Resektion von aseptischen Kiefernekrosen angewandt werden [7–12].

Aus unserer Klinik und Poliklinik für Unfallchirurgie am Universitätsklinikum Regensburg wurde bereits eine klinische Fallserie zur Autofluoreszenz-gesteuerten Knochenresektion bei chronischen Knocheninfektionen veröffentlicht. Im Rahmen einer ersten Pilotserie an zehn Patienten konnte die intraoperative Fluoreszenzdarstellung osteonekrotischer Areale bereits erfolgreich auf die Anwendung bei Patienten mit chronischen Knocheninfektionen übertragen werden [13]. Bei der Resektion nekrotischer Anteile des infizierten Knochens der eingeschlossenen Patienten konnte mithilfe der VELscope®-Methode vitales von avitalem Knochengewebe unterschieden werden. Es wurden somit lediglich kleinflächige Resektionen der hypofluoreszenten Areale durchgeführt und zur Bestätigung der Resektionsgrenzen Knochen-Biopsien vor und nach der VELscope®-gestützten Resektion entnommen. Die Resektionsränder nach fluoreszenzgesteuerter Resektion zeigten stets vitalen Knochen (s. Abbildung 1) [13]. Im Zuge des weiteren Erkenntnisgewinns für diese interessante Technologie planen wir daher nun eine ex vivo Untersuchung an intraoperativ gewonnenen Knochenproben.

Anhand von frischen humanen Knochenpräparaten (Femurkopf, Schenkelhals), die bei Hüft-Prothesen-Operationen entnommen werden, soll die Autofluoreszenz in Abhängigkeit im Zuge der eintretenden Nekroseprozesse mittels VELscope untersucht und mit den histologischen und EM-Ergebnissen verglichen werden. Die Knochenproben werden unmittelbar nach der intraoperativen Entnahme in unser Labor für Experimentelle Unfallchirurgie gebracht und direkt mittels VELscope®-Autofluoreszenz untersucht. Zum gleichen Zeitpunkt werden die ersten Konchenproben entnommen und für die histologischen und EM-Analysen vorbereitet. Der Untersuchungsablauf wird nach 12, 24, 48 und 96 Stunden sowie 10 Tage nach Entnahme wiederholt. Für die Dauer der Untersuchung werden die Knochenproben in einer isotonen Elektrolytlösung mit Antibiotika-Zusatz bei Körpertemperatur im Brutschrank gelagert. Die während der Untersuchungszeitpunkte entnommenen Knochenstanzen werden in einem standardisierten Verfahren mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt. Zusätzlich ist zur Analyse der Veränderungen der extrazellulären Matrix eine Färbung mittels Goldner-Trichromfärbung geplant. Zudem werden frühe zelluläre Veränderungen im Rahmen der Nekrose mittels elektronenmikroskopischer Analyse festgehalten. Bei der histologischen und elektronenmikroskopischen Untersuchung werden die Untersucher bezüglich der Fluoreszenzdarstellung der Proben sowie des Entnahmezeitpunkts verblindet. Die Auswertung der Fluoreszenz-Darstellung erfolgt anhand der Farbintensität semi-automatisiert mithilfe Software ImageJ (National Institutes of Health, USA). Anschließend wird die Farbintensität der Fluoreszenz mit den histologischen Ergebnissen und EM korreliert. Die Ergebnisse können zur Verbesserung der intraoperativen Diagnostik von nekrotischen Knochenarealen dienen, zukünftig die Resektionsgrenzen beim Debridement bei Knocheninfektionen besser bestimmen zu können.

Referenzen:

1. Lew DP, Waldvogel FA. Osteomyelitis. The Lancet. 24. Juli 2004;364(9431):369–79.
2. Morgenstern M, Kühl R, Eckardt H, Acklin Y, Stanic B, Garcia M, u. a. Diagnostic challenges and future perspectives in fracture-related infection. Injury. 1. Juni 2018;49:S83–90.
3. Cierny GI, Mader JT, Penninck JJ. The Classic: A Clinical Staging System for Adult Osteomyelitis. Clinical Orthopaedics and Related Research®. September 2003;414:7–24.
4. Sanders J, Mauffrey C. Long bone osteomyelitis in adults: fundamental concepts and current techniques. Orthopedics. Mai 2013;36(5):368–75.
5. Forsberg JA, Potter BK, Cierny G, Webb L. Diagnosis and management of chronic infection. J Am Acad Orthop Surg. 2011;19 Suppl 1:S8–19.

Abbildung:

Beitrag von Maximilian Menger

BG Unfallklinik Tübingen, Unfall- und Wiederherstellungschirurgie

Auswirkungen von Cilostazol, einen Phospodiesterase-Hemmer, auf die Heilung der Pseudarthrose

Abstract:

Bis zu 10 % aller Frakturen zeigen eine verzögerte oder ausbleibende Heilung. In den letzten Jahrzehnten konnten eine Reihe von experimentellen Studien wichtige Erkenntnisse über die zellulären und molekularen Mechanismen der verzögerten Frakturheilung und Pseudarthrose gewinnen. Allerdings bleiben in vielen Fällen die Ursachen für die Entstehung der Pseudarthrose unklar. Für die betroffenen Patienten bedeutet dies oftmals einen verlängerten Rehabilitationsverlauf, der mit vermehrten Schmerzen und dem Funktionsverlust der betroffenen Extremität verbunden ist. Die schwierigen und langen Krankheitsverläufe beinträchtigen nicht nur den Patienten, sondern verursachen durch zusätzliche Kosten auch weitreichende Konsequenzen für das Gesundheitssystem.

Angiogenese und Vaskularisierung sind entscheidende Faktoren für eine erfolgreiche Knochenregeneration. Cilostazol ist ein selektiver Phosphodiesterase (PDE)-3 Hemmer, der den cyklischen Monophosphat (cAMP) Spiegel erhöht und dadurch zur Gefäßdilatation und Hemmung der Thrombozytenaggregation führt. Aus diesem Grund wird Cilostazol zur Behandlung der peripheren arteriellen Verschlusskrankheit (pAVK) eingesetzt. Darüber hinaus belegen experimentelle Arbeiten, dass Cilostazol die Expression von pro-angiogenen Wachstumsfaktoren stimuliert und damit die Angiogenese fördert.

Des Weiteren besitzen PDE-Hemmer selbst pro-osteogene Eigenschaften und stimulieren die Differenzierung und Proliferation von Osteoblasten. Unsere Arbeitsgruppe konnte bereits zeigen, dass Cilostazol die normale Frakturheilung verbessert. Allerdings gibt es bis heute keine Informationen, inwieweit Cilostazol die Heilung der Pseudarthrose beeinflusst. Aus diesem Grund soll der Einfluss von Cilostazol auf die Heilung der Pseudarthrose in einem etablierten Mausmodell untersucht werden.

Neben der Analyse der konventionellen Röntgenbilder, biomechanischen Daten, µCT, Histologie und Western blot Untersuchungen soll zudem das Kallusgewebe mit einer photoakustischen Bildgebung untersucht werden. Bei diesem neuen Verfahren wird Gewebe mit einem pulsierenden Laser bestrahlt, was wiederum zu einer thermoelastischen Expansion und damit einer Druckerhöhung im Gewebe führt, die messbare akustische Wellen aussendet. Dadurch ermöglicht die photoakustische Bildgebung zwischen oxygenierten und desoxygenierten Hämoglobin zu unterscheiden, und ermöglicht damit eine Echtzeit-Darstellung der Gefäßdurchblutung und Gewebeoxygenierung im Kallusgewebe.